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光合作用第二阶段的化学反应可以在没有光能的情况下进行。这一阶段称为暗反应阶段，在叶绿体内的基质中进行。
在暗反应阶段，绿叶从外部吸收的二氧化碳不能被氢气直接还原。它必须首先与植物中含有五个碳原子的化合物结合。这个过程叫做二氧化碳固定。二氧化碳分子被五碳化合物分子固定后，迅速形成两个含三个碳原子的化合物。在相关酶的催化下，三种碳化合物接受ATP释放的能量，被氢还原[H]。其中一些三碳化合物经过一系列变化形成糖；其他三碳化合物经过复杂的变化，形成五碳化合物，使暗反应阶段的化学反应循环进行。
