限制酶的识别位点大多是反向对称的反向链接，如果只用用同种酶切，所得片段的2端序列相同，在连接时，是随机连接，不仅会出现反向连接，而且会出现片段串联filezilla乱码。

在分子克隆实验中如何做推广反向链接，我们会用两种酶分别切目的基因和质粒的上下游，这样就保证了目的片段和质粒片段在连接时的方向性，如上游都用EcoR I，下游都用BamH。

你所理解的“目的基因与质粒不就是本应该用同一种限制酶切割”，指的就是两者上游同用一种，下游又同用另一种，而不是指上下游都用同一种酶切反向链接。

除非是某些特殊情况反向链接，不得不用一种酶切上下游，这样会出现大量的反向连接，连接后，需要多挑些克隆鉴定。

个人见解，仅供参考，祝好反向链接！